Thèses & HDR

L’objectif principal de la thèse est d’étudier les rôles des acteurs non chromatiniens dans le maintien de l’épigénome au cours du cycle cellulaire en caractérisant l’influence de la perte de l’enzyme E(z) chez la diatomée, Phaeodactylum tricornutum. Cette espèce possède un génome séquencé. De plus, elle présente différents morphotypes (ovale, fusiforme, triradié, cruciforme). Son épigénome a été caractérisé pour de nombreuses marques épigénétiques comme H3K27me3. L’enzyme E(z) est conservée chez cette espèce et elle est nommée PtEZH. En outre, cette diatomée présente un cycle cellulaire bien caractérisé qui dure environ 10h, et il est possible de synchroniser en phase G1 les cellules de P. tricornutum grâce à une incubation prolongée à l’obscurité. Afin d'étudier les rôles d’E(z) sur le maintien de la marque épigénétique H3K27me3 au cours du cycle cellulaire chez P. tricornutum, des lignées perte-de-fonction pour l’enzyme PtEZH seront produites par conjugaison bactérienne avec la méthode CRISPR-Cas9 dans les 4 morphotypes de Phaeodactylum tricornutum. Les effets de la perte de l’activité de PtEZH seront évalués sur l’abondance et la localisation de la marque H3K27me3 à l’échelle nucléosomale au cours du cycle cellulaire.

Introduction and Problem Statement Parasitic plants of Orobanchaceae family, especially Phelipanche spp. are devastating obligate holoparasites that are spread in regions of the Mediterranean Sea and West Asia (Delavault, 2015) that in some cases can cause 100% crop loss (Abang et al., 2007) and are nearly impossible to control with traditional methods. The parasite-host connection via haustorium establishes water and nutrients uptake, exchanges of macromolecules such as proteins, DNA segments, mRNAs (Kim & Westwood, 2015), as well as small RNAs (Tomilov et al., 2008; Bandaranayake & Yoder, 2013). sRNAs act as signals in RNA interference which recently has been suggested for controlling pests, weeds, and pathogens of crop plants (Aly et al. 2009; San Miguel and Scott 2016; Mitter et al., 2017). In the past few years, several studies have shown the effectiveness of nanoparticles as carriers to deliver cargos to plants (Demirer et al., 2019). DNA nanostructures are predesigned DNA strands that due to their programmability and ready access to modification have an advantage over other nanomaterials (Bujold et al., 2018), and their functionality for delivering cargos such as RNA, DNA, and proteins to living cells have been investigated (Zhang et al., 2019). Research Method We aim to control broomrape by silencing some of the critical genes for parasite success such as genes involved in the osmoregulation process (e.g. M6PR, SuS1, and CWI genes) and possibly in haustorium formation (e.g. expansin, QR, and/or hormonal regulators of the process) and flowering pathway (e.g. ACS or a putative FD protein) by host-induced gene silencing (HIGS) and spray- induced gene silencing (SIGS) via the help of nanoparticles using the methods of either Mitter et al., (2017) or Zhang et al., (2019). To disrupt the flowering pathway, an investigation will be done comparatively to find the putative genes involved in the flowering event. To this end, the genomic and transcriptomic data available on online databases e.g. the Parasitic Plant Genome Project (http://ppgp.huck.psu.edu) will be exploited. Besides, we aim to target multiple genes simultaneously by a combinatorial silencing construct using the methods described previously (Zhang et al., 2018; Lunardon et al., 2021). Different experimental approaches such as qRT-PCR analysis, northern blot, and or small RNA-seq will be used for siRNA analyses. Expected Results and Output of the Study We predict that the results of this study include i) obtaining the nanoparticle composition that has the best ability to carry and, release dsRNA as a SIGS controlling method, ii) development of resistant lines of tomato to broomrape using the HIGS method, and iii) identification of putative genes that are involve in the flowering of broomrape and can be targeted for silencing. In total, we expect enhanced resistance of tomato to broomrape and reduced infection by and increased mortality of broomrape parasites which could be a promising achievement for the agricultural lands under the infestation of these parasites.

Les bioconjugués trouvent de plus en plus d'applications dans les matériaux et la médecine. Parmi eux, les vaccins glycoconjugués constituent une classe de vaccins particulièrement efficace pour lutter contre les infections bactériennes (vaccins contre les méningocoques ou les pneumocoques, par exemple). Cependant, les vaccins glycoconjugués formés à partir d'antigènes polysaccharidiques liés à une protéine dite protéine porteuse ne permettent le recrutement que d'une population restreinte de cellules immunitaires. De plus, ilst sont encore obtenus de manière largement empirique. Ainsi les glycoconjugués sont hétérogènes, difficilement caractérisables et ni le nombre d’antigènes polysaccharidiques, ni leur site de greffage à la protéine porteuse ne sont parfaitement contrôlés lors de leur préparation alors même qu’il a été établi que ces paramètres impactaient considérablement la qualité de la réponse immunitaire. L’objectif de la thèse est de mettre au point une nouvelle génération de vaccins glycoconjugués totalement homogènes et auti- adjuvantés en utilisant les infections à pneumocoques comme modèle d’étude. En alliant la synthèse organique, la production de protéines recombinantes par des techniques de mutagenèse et d’incorporation d’acides aminés non naturels et le recours à des réactions de bioconjugaison sélectives et performantes, il s’agira pour la première fois d’accéder à des glycoconjugués homogènes. Est-il possible d’étendre la réponse immunitaire induite par les vaccins glycoconjugués actuels médiée par le recrutement des lymphocytes T CD4+ ? Pour répondre à cette question, les glycoconjugués homogènes seront dotés de propriétés auto-adjuvantes apportées par la protéine porteuse ou par un adjuvant synthétique greffé sur la protéine porteuse pour permettre une réponse immuntaire large grâce à l’activation du Toll-Like Receptor 5 ou des lymphocytes T innées.

Le processus métastatique débute avec al migration de cellules tumorales du site tumoral primaire vers des organes distants cibles après leur passage dans la circulation sanguines où elles sont appelées cellules tumorales circulantes (CTCs). En phase de rémission, les cellules tumorales ne sont détectables mais peuvent persister à bas bruit dans l'organisme et être réactivées ultérieurement (maladie récurrente). Les CTCs sont des marqueursbiologiques de l'évolution de la maladie et permettent de suivre de la maladie résiduelle. Ainsi, la détection et la caractérisation moléculaire des CTCs dans le sang sont devenues des enjeux cruciaux pour le développement de thérapies personnalisées en oncologie. L'analyse des CTCs fait face à deux difficultés techniques : rareté (1-10/mL de sang) et hétérogénéité des CTCs. Ace jour, différentssystèmes ont été commercialisés pour les isoler et incluent une étape de pré-enrichissement et une d'isolement. Les méthodesde pré-enrichissement actuelles ne permettent pas de collecter toutes les CTCs (taille variable, expression variable d'antigènes) et l'utilisation de deux systèmesdistincts (sans culture) accroit le risque de perte des cellules. De plus ceux-ci ne permettent pas la mise en culture d'un très petit nombre de cellules pour le criblage de drogues. Les objectifs de la thèse sont de:

• développer et optimiser un système microfluidique multifonctionnel miniaturisé permettant d'isoler, de concentrer et de cultiver en 3D les CTCs des patients (« système 3 en 1 »: pré-enrichissement, isolement. culture),
• étudier l'impact du microenvironnement tumoral (co-cultures) sur le développement en 3D des CTCs (micro-tumeurs)et leurs propriétés (moléculaires) à l'aide de microchambres.
• cribler de nouvelles molécules thérapeutiques à l'aide de ces systèmes « 3en 1».

Le projet proposé est un projet de recherche translationnelle s'intégrant dans une démarche de développement d'outils dédiés à la médicine personnalisée.

L'orobanche du tournesol, Orobanche cumana, est la contrainte biotique la plus importante pour la production de graines de tournesol dans tous les pays où celui-ci est cultivé, sauf en Amérique du Nord et du Sud. Plusieurs stratégies de lutte ont été employées contre les orobanches, mais aucune d'entre elles n'a abouti à un succès sans équivoque. Actuellement, le moyen le plus efficace d'empêcher l'expansion des plantes parasites de racines est la résistance génétique, utilisée avec succès essentiellement chez le tournesol. Le processus d'exploitation trophique par la plante parasite est régi par un dialogue moléculaire bien réglé entre les deux partenaires. Parmi les mécanismes sophistiqués qui permettent au parasite de détecter la présence d’une plante hôte et de coordonner son cycle de vie avec celle-ci, son processus particulier de germination est probablement le plus important. En effet, ce stade précoce du développement est essentiel à sa survie, car une graine germée qui ne parvient pas à se connecter à un hôte épuisera rapidement ses réserves d'énergie et mourra. Les orobanches compensent cela en ayant des exigences strictes pour la germination, impliquant la présence de molécules chimiques spécifiques exsudées par les racines de l'hôte, les stimulants de germination (GS). On sait depuis des décennies que ces substances allélochimiques appartiennent principalement à la famille des strigolactones (SL), mais ce n'est que récemment que leur récepteur, une α/β-hydrolase (D14/KAI2), a été découvert. Cette interaction ligand/récepteur apparemment simple est en fait complexe. En effet, outre les SL, d'autres classes de métabolites secondaires végétaux ont été identifiées comme GS. Par exemple, le déhydrocostus lactone (DCL), une sesquiterpène lactone guaianolide (SqTL), est exsudé par les racines de tournesol et stimule spécifiquement la germination des graines d'O. cumana. Deuxièmement, la protéine réceptrice appartient à une famille multigénique KAI2 chez les plantes parasites de racines (au moins 8 séquences KAI2 chez O. cumana). Le programme de recherche vise à identifier les récepteurs KAI2 des stimulants de germination (strigolactones et lactones sesquiterpéniques) chez la plante parasite O. cumana. Grâce à la disponibilité des séquences génomiques de plusieurs populations d'O. cumana, la biodiversité des récepteurs KAI2 sera évaluée et le polymorphisme observé sera ensuite corrélé à la réponse aux stimulants de germination dans les populations d'O. cumana grâce à un test à haut débit permettant d’évaluer la germination des graines de plantes parasites. Une sélection de séquences KAI2 représentatives de la diversité sera ensuite clonée pour la production des protéines correspondantes dans E. coli et la complémentation du mutant kai2-2 d'Arabidopsis. Les protéines recombinantes et les lignées d'Arabidopsis complémentées seront ensuite testées pour leur capacité et leur spécificité à lier et percevoir les stimulants de germination. Le travail doctoral proposé s'inscrit dans le cadre du programme ANR STIGO 2022-2025.

La reconnaissance multiparamétrique de biomarqueurs label-free en temps réel à haute sensibilité associées à des données cinétiques est un paradigme du diagnostic in vitro moderne. De nos jours, deux types de capteurs optiques label-free ont été décrits, l’un basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR) dans les films d'îlots métalliques et l’autre utilisant des ondes de surface (SW) dans des cristaux photoniques (PC). Ces capteurs peuvent détecter simultanément jusqu'à dix types de biomolécules à la surface d'une biopuce. Les biocapteurs utilisant des SW PC présentent une sensibilité plus élevée que les supports SPR.

Confidentiel

Parkinson's disease (PD) is a progressive disease and the second most common neurodegenerative disorder. Pathologically, PD is characterized by the loss of dopaminergic neurons of the substantia nigra and α-synuclein aggregation which lead to motor and cognitive dysfunction. Is believed that other pathways may also be involved such as oxidative stress and neuroinflammation and can also affect other neuronal connections. Currently, there are no therapeutic alternatives able to cure PD. Pharmacological therapy options are focused on symptoms relief and management. Therefore, exploring molecules that can act in the prevention or treatment of PD is necessary. Resveratrol has attracted attention for its anti-inflammatory and antioxidant activities, but its therapeutic effectiveness is limited due its low solubility in aqueous system and low bioavailability. Molecule glycosylation via synthetic induction of structural optimization reactions using enzymes appears as an alternative, guaranteeing specify and regioselectivity. First, we aim to synthesize and controlled functionalize the resveratrol molecule through enzymatic pathways. This part of the work will be done in US2B, Nantes Université, France. The implementation of such a process will increase the solubility and bioavailability of these functionalized compounds, being able to potentiate their biological responses, allowing specific therapeutic applications. We also purpose to predict the pharmacokinetic parameters of resveratrol and its glycosylated forms, as well as its molecular interactions with PD targets using in silico approaches. Furthermore, we will evaluate the toxicity and effects of resveratrol glycosylation in a zebrafish (Danio rerio) in vivo experimental model of PD at the Universidade Federal do Rio Grande, Brazil.

Le comportement bactérien, principalement étudié à l’échelle de la population, est la conséquence de multiples interactions entre une cellule bactérienne et son microenvironnement immédiat, qu’il soit biotique ou abiotique. Il est donc indispensable d’étudier ces interactions à l’échelle microscopique. Un des aspects les plus fascinants dans l’étude du comportement individuel des bactéries est la découverte de l’existence de leur comportement social, incluant le partage de ressources ainsi qu’un mécanisme de division du labeur. La socio-microbiologie est une science récente, de pointe, encore très peu pratiquée. Tout au long de ma carrière, j'ai démontré une capacité à développer des idées originales dans cette thématique, alternant les approches à l’échelle de la communauté et à l’échelle de la cellule unique. Mon doctorat a été consacré à la compréhension de la manière dont les micro-organismes peuvent se développer dans pratiquement tous les environnements, même les plus extrêmes comme les drainages miniers acides (DMA), fortement contaminés en métaux lourds. Ces approches, menées à l’échelle de la communauté, ont été complétées lors de mon postdoctorat à Lausanne (2013-2017) par l’étude du comportement bactérien à l’échelle de la cellule unique, afin de caractériser la capacité de bactéries isogéniques à diverger en sous populations phénotypiquement différentes, et de comprendre les origines évolutives sous jacentes. En utilisant des approches microscopiques de pointe en temps réel et à l’échelle de la cellule unique, j'ai démontré dans des souches de Pseudomonas que le transfert horizontal d'un type d’îlots génomiques appelé élément intégratif et conjugatif (ICE) est restreint à une sous population de cellules phénotypiquement différenciées au sein d’une population isogénique, et que cette hétérogénéité permet une meilleure fitness de l’ICE. J'ai poursuivi cette niche de travail de pointe lors de mon 2e post-doctorat à Brest (2017-2019), en appliquant des concepts similaires pour apprécier l'étendue et l'importance du comportement hétérogène et social de bactéries pathogènes. La bactérie modèle était Vibrio harveyi ORM4, une bactérie marine infectant l'ormeau européen Haliotis tuberculata. J'ai suivi les interactions hôte-pathogène à l’échelle de la cellule unique, en développant des outils génétiques et moléculaires pour cette souche. En outre, j'ai pu démontrer qu’un gène lié à la virulence est exprimé de manière hétérogène chez V. harveyi ORM4. En 2019, j'ai été recruté en tant que Maitre de Conférences à l’université de Nantes afin de poursuivre le développement de ma thématique en socio-microbiologie, dans un contexte d’interaction symbiotique entre des bactéries capables de fixer l’azote et des microalgues photosynthétiques. La fixation biologique de diazote dissous (N2) ou diazotrophie supporte une portion significative de la production primaire océanique et permet de rendre accessible le N2 récemment fixé à l’ensemble de la communauté planctonique. Dans des environnements carencés en azote, certaines cyanobactéries diazotrophes sont connues pour entretenir des interactions symbiotiques avec des microalgues et notamment les diatomées. De plus, d’autres cyanobactéries filamenteuses sont capables d’avoir un comportement hétérogène et social, divisant le labeur pour l’activité de diazotrophie, restreinte à une sous-population de cellules appelées hétérocystes. Cependant, des approches récentes menées sur des ADN métagénomiques d’origines marines ont montré l’existence en abondance de diazotrophes non cyanobactériens (DNC) dans les océans. Ces DNC pourraient jouer un rôle important dans les cycles biogéochimiques de l’azote, mais aussi du carbone via une entrée en interaction avec des microalgues photosynthétiques. Cependant, et malgré leur importance potentielle, aucune étude ne s'est attachée à comprendre le rôle des DNC marins dans l'établissement d'interactions symbiotiques avec les microalgues. L'étude de leur mode de vie révèle en effet des difficultés, essentiellement parce que la plupart des DNC marines restent récalcitrantes à la culture et parce qu'aucune microalgue marine dépendante de DNC pour se développer n’a été découverte. C’est dans ce cadre que se situe mon projet de recherche actuel. Les projets proposés visent à étudier des couples DNC-microalgue, qui vont servir de base pour répondre à ces questions d’importance autant fondamentales qu’écologiques, puisqu’elles peuvent changer de paradigme dans la compréhension des cycles biogéochimiques de l’azote et du carbone dans les océans.